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전립선암 세포는 셀레니움 이온에 민감하다

  • 전립선암에서 녹차의 항암 메커니즘
  • - 녹차와 금속 이온의 상호 작용 ?
  • Shengrong Shen
  • Department of Tea Science, Zhejiang University, China
  • 1. 전립선암에서 금속 이온의 작용
  • 1.1.1 전립선암에서 발생하는 아연 이온의 대사
  • 아연 이온은 건강에 있어서, 필수불가결한 coenzyme이다. 많은 질병에 있어서 이 아연 이온의 결핍이 매우 중요한 원인이 되고있다. 특이하게도, 전립선의 상피세포에는 체내의 어떤 세포에서보다도 높은 농도의 아연 이온이 축적되어 있다. 이 같은 사실로 볼 때, 아연 이온이 전립선의 정상적인 기능과 병리적 작용등에서 중요한 역할을 하며, 동시에 전립선암을 진단하는 좋은 Marker로 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.
  • Feustel A. 등(19)은 정상인과 BPH(양성 전립선 과형성)환자에서 추출한 핵, 미토콘드리아, 세포질 내의 아연과 카드뮴 이온의 분포를 원자 흡광계(AAS)를 이용하여 조사하였다.
  • 정상인과 BPH환자, 미분화된 암 조직에서는 아연과 카드뮴 이온의 농도가 큰 차이를 보였다. 즉, 일반인에 비해 환자의 경우, 카드뮴 이온의 농도가 매우 높았고, 아연 이온 농도는 매우 낮았다.
  • Bataineh Z.M.등(20)도 정상인과 급성 전립선암, 양성 전립선 종양, 그리고 선암종(腺癌腫)에 있는 전립성 상피세포의 핵과 세포질 내의 아연 이온을 정량적으로 측정하였다. 정상인과 급성 전립선염, 양성 전립선 종양, 그리고 선암종(腺癌腫)의 전립선 조직은 환자들로부터 채취하여 X-선 미량분석법에 의해 아연의 농도를 측정하였다. 시료는 2~3년에 걸쳐 채취하였고 요르단 어비드의 요르단 과학기술대학에서 분석하였다.
  • 그 결과 양성 전립선 종양과 선암종(腺癌腫)에 있는 선상피세포(腺上皮細胞)의 아연 이온은 핵과 사이토플라즘 모두에서 감소하였다. 이런 현상은, 악성 전립과형과 전립 adeno-carcinoma 에서 나타났다. 급성 전립선암의 경우 핵과 세포질내의 아연 이온의 농도가 증가하는 것으로 나타났지만, 그 증가정도는 매우 미비하였다.
  • 이런 현상은 아연 이온 대사과정에 직접적으로 영향을 끼치는 인자에 의한 것이거나, 혹은 아연 이온 결합 단백질인 metallothionein에 의한 것으로 생각된다. Zaichick V.Y. 등(21)은 정상인과, 급성 전립선염 환자, 전립선암 환자로부터 뽑은 전립선액의 아연 이온의 농도를 에너지 확산 X-ray 형광법으로 조사한 결과, 정상 전립액에 존재하는 아연 이온의 농도는 590 ± 45(SE) ㎍/ml 이였다.
  • 만성 전립선염과 선암종(腺癌腫)과의 아연농도는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 전립선 종양은 아연 이온의 분비가 급속한 감소하여 일어난다. Lekili M. 등(22)은 전립선암 환자와 BPH를 상대로 치료 전후에 변화되는 혈청 내 아연 이온의 농도를 측정하였다.
  • 그 결과, 전립선암 환자와 BPH환자에서 큰 변화가 나타났는데. 특히 암환자의 경우 치료 전후에 뚜렷한 변화가 나타나는 것으로 확인되었다. 따라서, 아연 이온의 농도는 전립선암 치료와 진단에 있어서 중요한 지표가 될 수 있다.
  • 아연-a-2-glycoprotein(ZAG)은 분자량 41,000의 glycoprotein으로서 여러 정상적인 상피세포에서 분비된다. 최근 ZAG은 지방세포에서 지방분해를 촉진시킴으로써, ZAG을 생산하는 Tumor가 동물에서 악액질(惡液質,cachexia)현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. Laura P.H.등(23)은 악성 전립선암 상피에서 발현되는 ZAG가 전립선암을 발견하는 혈청인자로 사용될 수 있음을 보여주었다. Kallikrein Protease Prostate-Specific Antigen(PSA)은 사람의 전립선암 세포의 침입에 필요한 기능을 함으로 전립선암을 진단하고 감시하는 표지로 사용할 수 있다.
  • 전립선암을 포함한 많은 질병의 발생에서 아연 이온의 농도가 증가하는 것으로 볼 때, 식사와 아연 이온의 섭취가 대채 의약으로 많은 관심을 끌고 있다. 아연 이온이 Wilson’s disease 등과 같은 희귀질병을 약화시킨다는 몇몇 의학적 보고도 있다. 그러나 아연 이온은 BPH와 같은 전립선 질병과 밀접한 연관이 있다. 과도한 아연 이온 섭취는 BPH를 암화시킬 수 있는 잠재적인 유도체로 작용할 수 있다. 실제로 대규모의 한 연구결과에서는 아연 과도하게 섭취한 경우 전립선암의 발병률이 매우 높았다(24,25).
  • 1.1.2 전립선암의 진행에 있어서 아연 이온의 영향
  • 전립선에서 아연 이온의 농도는 악성 전립선암의 발전과 진행과 연관이 있다고 보고되고 있다.
  • 아연 이온의 농도는 전립선암이 androgen-independent 시기로 진행되는 동안 감소한다. Iguch K. 등(26)은 이 메커니즘을 연구하였는데, androgen에 반응성을 보이는 LNCaP 세포와 andeogen-independent(AIDL)인 세포를 이용하여 이들에서 metallothionein과 아연 transporter의 발현 비율을 조사하였다. AIDL 세포는 LNCaP 보다 아연 농도가 낮았다. 그리고 LNCaP에 비해 androgen receptor 발현이 낮았다. 또한 AIDL은 LNCaP에 비해 아연 transporter 1(ZnT1)의 발현은 낮았으나, ZnT3의 발현은 높았다.
  • 주요 아연 결합 단백질인 Metallothione의 농도는 LNCaP에 비해 AIDL세포에서 현저하게 낮았다. LNCaP 세포를 호르몬을 제거한 우태아혈청을 첨가한 배지에서 배양하면 ZnT3 mRNA의 발현이 감소하였고, 배지에 합성 androgen 1881을 첨가해주면 증가하였다. 반면 이러한 조건에서도 세포내의 아연 농도는 변하지 않았다.
  • 이 같은 발견은 ZnT3와는 달리 ZnT1과 Metallothioneins와 같은 인자들은 AIDL 세포에 내부의 낮은 아연 이온의 농도와 관련이 있음을 시사한다. Henshall S.M. 등(27)은 초기 전립선 질환이 침입성 전립선암으로 진행되는 과정에서 아연의 transporter Tn4의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. Rishi I. 등은 미국 흑인에서의 전립선암은 아연 transporter의 감소와 연관이 있음을 발견하였다.
  • 아연 이온은 전립선암을 치료하는데 매우 중요한 역할을 한다. 전립선암의 성장을 억제하는 데 매우 중요하다.
  • Liang.J.Y. 등(28)은 두 종류의 전립선암 세포주(LNCaP, PC-3)에서 아연 이온이 존재할 때와 존재하지 않을 때에 일어나는 성장저해와 여러 조절반응을 조사하였다. 이 세포주를 생리적 수준의 아연 농도에서 배양했을 때, 세포의 성장이 저해되는 것을 확인하였다.
  • 아연 이온의 IC50를 측정한 결과 androgen-independent PC-3 세포는 IC50 값이 높았다. 1㎍/ml 농도의 아연은 두 세포 주에서 최대의 억제효과를 보인다.
  • 이 같은 억제효과는 세포 내 아연이온의 축적과도 연관이 되어 있다. 사람의 전립선암 세포주 PC-3, LNCaP 에서 나타나는 침입성에 대한 아연의 효과를 Transwell 세포배양기를 이용 in vitro에서 조사하여, MMPs, uPA, AP-N 대한 특이적인 단백질 저해제와 각각 비교하였다. PC-3의 침입성은 아연 이온과 다른 단백질 저해제에 의해 효과적으로 억제되었다. 반면 LNCaP에서는 거의 효과가 없었다.
  • 정제된 AP-N의 활성은 PC-3 세포의 침입성을 억제하는 같은 농도에서 강하게 저해 받았으며, 경쟁적 저해였다.
  • 정제된 uPA 역시 아연에 의해 억제 받기는 하지만 AP-N에서와 달리 비경쟁적 저해였다. AP-N은 조사한 세포 중에서 PC-3의 세포막 분획에서 가장 많이 발현되었다.
  • 이 결과로 보아, AP-N과 uPA가 사람의 전립선암의 침입성에 연관되어있으며, 아연 이온은 인간의 전립선암에서 AP-N과 uPA의 효소활성을 조절함으로 암세포의 침입과 전이에 관여할 수 있다. Robert G.U. 등(29)은 Immunoblotting과 Immunohistochemistry에 의한 연구를 통해서, 생리적 수준의 아연 농도에서 인간의 전립선암 세포주 PC-3와 DU-145의 NF-kB의 활성이 억제되었고, NF-kB에 의해 조절되는 항괴사 단백질 c-IAP의 발현이 감소하였으며, c-Jun N-terminal Kinase(JNK)가 활성화 하였다. 이처럼 아연 이온의 저해작용은 악성 전립선암의 진행과 발달을 설명할 수 있는 메커니즘 중의 하나이며, 전립선암의 예방과 치료에 있어 중요하다.
  • Feng P. 등(30)은 첫째 m-aconitase의 억제, 둘째 mitochondrial apoptogenesis의 유도라는 아연 이온의 두 가지 중요한 효과를 발견하였다. Kazuhiro I. 등(31)에 의하면 아연 이온에 노출했을 때 암세포의 괴사가 일어났다. 이 결과는 아연 이온이 세포의 괴사를 유도할 수 있음을 시사하고 thymosins와 같은 단백질의 생성이 세포박리 과정을 유도한다고 여겨진다.
  • 아연 이온은 많은 단백분해효소에 있어서 효과적인 조절 인자이다. 정제된 PSA의 효소적 기능은 아연 이온에 의해서 강하게 억제된다. 전립선암 특이 항체 PSA를 발현하고 분비하는 LNCaP 세포는 Matrigel을 침입하는 기능을 갖는데, 이 활성은 정제된 PSA의 활성을 저해하는 농도와 같은 농도의 아연에 의해 강하게 저해 받는다.
  • 아연 이온은 정제된 PSA에 의한 Matrigel의 분해를 효과적으로 억제한다.
  • 더욱이 사람의 전립선에 있는 아연 이온은 PSA의 단백질분해 활성를 조절함으로 전립선암의 전이와 침입을 막는다. 아연 이온에 의해 PSA의 단백질분해능이 억제되지 않는 경우 침입성을 갖게 된다. 대부분의 암세포에서 telemorease 의 활성이 증가하게 되면, 암세포가 무제한 증식하게 된다고 알려졌으므로, 이 같은 telomerase를 억제하는 것은 암의 치료에 있어서 매우 매력적인 방법으로 여겨지고 있다. Nemoto K. 등(32)은 아연 이온이 전립선암 세포주 DU-145에서 telomerase를 활성화 시킨다고 밝혔다.
  • 아연 대사 단백질들은 인간의 전립선의 항상성을 유지하는데 관여하며, 이 아연 대사 시스템은 악성 조직에서는 다를 수 있다. Hasumi M. 등에 의하면 PC-3 세포에 아연 이온을 처리하면 ZnT-1 단백질이 활성화된다고 보고하였다.
  • In-Vivo에서 아연 이온이 전립종양의 성장에 미치는 영향은 몇몇 그룹에 의해 연구되었다. Feng P. 등(14)은 nude mouse에서 아연 이온이 암 발생에 미치는 영향, 아연 이온의 tumor조직 축적, 미토콘드리아 세포막 투과에 관련된 단백질인 Bax/Bcl-2를 조사했다. nude mouse에 PC-3 세포를 접종하여 암 발생 동물 모델을 만들었다. 실험 쥐에 ALZET 삼투압 펌프를 이용해 아연 이온을 처리하였다. 아연 이온을 처리하면 아연 이온이 축적되었고, PC-3 세포에 citrate가 생산되어 암 조직을 유도하고 암의 성장을 억제하였다. 이러한 아연 이온의 억제효과는 미토콘드리아의 세포막 투과성에 관련하는 Bax/Bcl2의 조절에 의한 아연에 의한 세포사멸의 결과이다..
  • 1.2 전립선암에 있어서 카드뮴의 효과
  • 1.2.1 전립선암의 발생과 카드뮴 이온과의 연관성
  • 카드뮴 이온은 1993년 IARC에 의해 인간에 대한 발암물질로 규정되었다. 역학적인 조사와 동물실험 결과 카드뮴이 전립선에 암을 일으킬 수 있음을 제시하였다. Waalkes M.P. 등(33)은 쥐에서 실행한 세가지 실험을 통해서, 카드뮴 노출이 전립선암을 유발시킬 수 있음을 보였다. 전립선의 카드뮴 이온의 축적과 유지는 남성호르몬과 밀접한 관계를 가지고 있다. 또한 카드뮴 내성과 관련된 단백질, metallothionein이 쥐의 전립선에는 없었다.
  • 전립선의 복부엽(ventral lobe)에 있는 metallothionein 유전자는 금속이온에 대해 반응하지 않는다.
  • 카드뮴을 처리한 쥐에서 전립선암이 발생한다는 사실은 사람에 있어서도 카드뮴의 노출이 전립선암을 일으킬 수 있음을 보여준다. 전립선암은 전염 될 수 있으며 카드뮴과 같은 환경적 요인이 부분적으로 그 원인이 될 수 있다.
  • Micheal P.W. 등(34)은 쥐에서 전립선의 손상에 특별한 관심을 두고 카드뮴 이온의 만성 독성과 발암 효과를 조사하였다.
  • 염화카드뮴을 10주된 쥐에 한번 주사하고 72주까지 효과를 관찰하였다. 낮은 농도의 카드뮴을 주사하였을 때는, 전립선 배측부(背側部 dorso lateral)에 증식손상이 농도 의존적으로 증가하였다. 이때, 손상은 stroma 침입은 없고 비정상적인 상피세포가 간혹 나타나는 상피 내 신생물이라고 나타낼 수 있다.
  • 농도가 올라가면 전립선 배측부(背側部 dorso lateral)의 증식손상 반응은 점차 감소하여 대조수준까지 내려간다. 이처럼 높은 농도에서의 전립선암 반응이 감소되는 이유는 카드뮴 이온 다음으로 정소의 기능이 상실되기 때문이라 추정된다. 이는 매우 높은 손상의 발생을 의미하며, 관상조직의 퇴행, 무기질 침착, 간질세포의 종양발생과 같은 정소의 기능저하를 나타낸다. 악성 주사부위에 관찰되는 sarcoma는 두 군에서 관찰되었고, 뇌하수체 adenoma는 가장 높은 카드뮴 농도에서 증가하였다.
  • 이 결과는 카드뮴이 쥐의 전립선 배측부에 분열적 손상을 일으킴을 보여주고 있다. Nakamura K. 등(35)의 연구에서 SV-40에 의해 불멸화된 사람의 비암성 전립 상피 세포인 pRNS-1-1에 지속적인 카드뮴 노출을 하면 암으로 전환되었다. 이러한 전환은 세포의 형태적 변이, 비부착성 성장, SCID mice에 이식하였을 시 종양이 형성되는 것으로 확인되었다. 이때 이 암세포는 해부학적으로 분화가 잘되 않는 선암종(腺癌腫, adenocaecinoma)으로 PSA, AR, PSCA,NKX3.1 그리고 CK8등을 발현하였다. 이는 사람의 전립선 상피세포도 환경으로부터 유해한 화합물에 노출 되었을 때 악성으로 전이될 수 있음을 보여준다.
  • 1.2.2 전립암의 성장에서 카드뮴 이온의 효과
  • 전립선 암의 성장에 있어 카드뮴 이온의 효과는 아연 이온에 의해 감소된다. Mary B. M. 등(36)의 보고에 따르면 전립선암 세포 LNCaP에 카드뮴을 처리하면 암세포 성장이 촉진된다. 처리 4일째에 S+G2M의 비율이 2.4배 증가하였고 8일째에는 세포 수가 2.7배 증가하였다. 카드뮴은 AR 단백질과 mRNA의 농도를 감소시키고, 전립선 특이적 항원과 anti-androgen에 의해 차단되는 homeobox 유전자 NKX 3.1의 발현은 증가시킨다. 게다가 카드뮴 이온은 MMTV-luciferase repoter gene을 가진 mouse L 세포와 w/t ARrhk MMTV-CAT reporter 유전자를 삽입한 COS-1 세포에서 AR을 활성화 시킨다.
  • 카드뮴은 또한 AR의 hormone binding domain을 가진 chimeric receptor를 활성화시킨다. 카드뮴이온은 androgen이 수용체와 결합하지 못하게 하지만 결합의 친화력은 변화시키지 않는데, 이는 카드뮴이 호르몬 결합의 저해제라는 것을 의미한다. 정소를 제거한 동물에서, 환경에서 나타날 정도의 낮은 단 한번의 카드뮴 용량도 전립선과 정낭체(seminal vesicle complex)의 무게를 증가시켰고, 안드로젠에 의해 조절되는 유전자 probasin의 발현을 증가시켰다. 이러한 in vivo 효과 또한 항-안드로젠에 의해서 차단된다.
  • Ye J. 등(37)은 유전자 전사단계에서 androgen과 카드뮴 이온의 상호작용을 중심으로 카드뮴이온의 발암 메커니즘을 연구하였다. 사람의 전립선 상피 세포인 LNCap에 reporter 유전자를 삽입한 결과, 카드뮴은 안드로젠 없이도 reporter 유전자를 활성화시킬 수 있었고, 이러한 활성화는 안드로젠 수용체에 영향을 받았다. reporter 유전자를 삽입한 세포에 안드로젠과 카드뮴 이온을 동시에 처리했을 때 카드뮴 이온은 안드로젠 반응을 증가시켰다.
  • 카드뮴에 의한 reporter 유전자의 활성화는 세포증식이나 IL-6 생성과는 관련이 없었으며, 다른 실험에서 카드뮴에 의해 유도되는 암발생 과정과 관련이 있다고 하였다.
  • 카드뮴 이온은 AP-1을 약간 유도 하였다. 이 결과는 카드뮴이 전립선 상피 세포에서 안드로젠과 유사한 활성을 가지고 있음을 보여준다.
  • 1.3 전립선 암에 있어서 구리(Cu++)의 효과
  • 구리 이온은 많은 효소의 활성을 조정하고 생체내의 산화/환원 상태를 조절하는 중요한 성분이다. 구리 이온의 대사는 많은 질병과 연관이 있다. 구리 이온은 전립선 암의 진행에 있어 효소와 산화/환원 상태를 조절하는 역할을 할 수 있다. 혈청 내 구리 이온의 농도는 전립선 암의 진행과 관계가 있고 전립선암의 진단용으로 사용된다. Nayak S.B. 등(39)은 20명의 전립선암과 대장암 환자로부터 혈청 내 구리와 세룰로플라스민 수치를 조사하였다. 구리/ 세룰로플라스민 수치는 크게 차이가 나지 않았으나 구리와 세룰로플라스민 수치가 정상에 비해 암환자에서 크게 증가하였다.
  • 전립선 암에 있어서 구리 이온의 효과에 관한 보고들이 있다. 우리는 전립선 암 세포의 성장에 있어 구리의 효과를 조사하였다(40-42). MTT assay는 안드로젠에 반응하지 않는 PC-3와 안드로젠에 반응하는 LNCaP PCA 세포에 구리 이온을 처리 하면 24시간 후에 세포 생존율이 크게 감소하였다. 이 두 전립선 암 세포의 생존은 구리 이온의 농도에 비례하였다. Flow cytometry와 전기영동 결과 두 세포의 성장 저해 주요인은 괴사(necrosis)이며, 세포사멸(세포사멸)은 거의 일어나지 않았다.
  • 우리는 PCA 세포배양을 통해 괴사와 세포막의 손상을 연구하였고 세포막은 구리 이온의 중요한 타겟임을 발견하였다. Daniel K.G. 등(43)은 NCI-109268, [Cu(8-OHQ(2))와 같은 구리 화합물이 proteasome 저해제로서 전립선암 세포에서 세포사멸을 유도한다고 밝혔다.
  • 1.4 전립선 암에 있어서 셀레니움의 효과
  • 역학적 연구, 전임상 연구, 임상 중재연구를 통해 셀레니움 화합물이 강력한 암 예방제라는 사실이 알려졌다. 세포사멸의 유도와 세포성장의 저해는 셀레니움이 암 예방 효과를 보이는 중요한 세포 내 작용으로 생각된다. 세포사멸의 유도에 앞서 셀레니움 화합물은 수많은 세포주기 조절 단백질, 신호 전달 물질, 단백질 분해효소, 미토콘드리아 관련 인자, 전사 인자, 암 억제 유전자, 폴리아민과 글루타치온의 수치 등의 활성과 발현을 변화시킨다.
  • Zhong W. (44)등은 LNCaP 전립선 암 세포에서 셀레니움의 효과를 연구하여, 셀레니움 이온의의 급성, 만성 효과를 비교하기 위해 이 세포주에 6개월 이상 셀레니움 이온을 처리하였다. 고농도에서는 급성과 만성 처리 두 경우 모두에서 산화 스트레스가 야기되었지만 그 결과는 달랐다. 셀레니움 이온에 급성 노출된 세포는 미토콘드리아의 손상과 주로 세포사멸에 의한 세포의 사망이 나타났다.
  • 만성 노출된 세포는 세포주기의 정지, 미토콘드리아 수와 미토콘드리아 효소 수준의 증가가 있었으며, 약간의 세포사멸을 보였다. Immunoblotting 분석에서 많은 단백질들이 셀레니움의 만성 노출에 의해 증가됨을 보여주었다. 이중 산화/환원에 민감하며 세포주기를 조절하는 기능을 한다고 알려진 Mn-SOD와 p21의 증가가 세포 성장 저해와 관련이 있었다. 연구결과 셀레니움 이온이 세포내 산화/환원 상태를 변화시킴으로 결과적으로 세포주기를 정지시킴으로 사람의 전립선암에서 효능을 보였다. Venkateswaran V. 등(45)은 셀레니움 이온의 세포성장 저해와 세포주기 조절 단백질과의 관련성을 조사하였다.
  • 사람 PCA 세포(LNCaP, PC3, PC3-AR2, PC3-M)를 셀레니움 이온이 있거나 없는 상태에서 24, 48, 72 시간 동안 배양하였다.
  • 셀레니움 처리는 PC3 세포에 아무런 영향을 주지 않았으나, LNCaP 세포는 G1 상태로 정지되고 S 상태가 80% 감소되었다. 그러나 안그로젠 수용체를 삽입한 PC3(PC3-AR2)세포는 세포주기의 진행에서 G2/M 상태로 정지되고 S 상태가 57% 감소하였다.
  • 세포주기 조절 물질의 분석에서 셀레니움을 처리 세포는 cyclin-dependent kinase 저해제인 Cip1/p21과 Kip1/p27의 현격한 유도를 보였다. 이러한 데이터로 셀레니움이 PCA에서 강력한 항-증식 능력을 가짐을 알 수 있다. He Q. 등(46)은 셀레니움에 의한 세포사멸이 사람의 전립선암 세포에서 DR5 의존성 경로인 세포막 사망 수용체와 관련이 있다고 보고하였다.
  • 셀레니움 이온은 DR4는 변화시키지 않으나 특이적으로 DR5의 발현을 증가시킨다. 셀레니움이 DR5를 증가시키는 것은 caspase 8의 활성과 Bid의 분해와 연계되어있는데, 이는 DR5 미토콘드리아 경로 사이에 상호간 신호전달이 있음을 시사한다.
  • DR5는 특별히 셀레니움 이온에 의해 조절되고 그의 활성화는 셀레니움에 의한 화학적 예방에 있어 중요한 역할을 한다. Water D. J. 등(47)은 식이 셀레니움 이온의 보충이 전립선 조직의 DNA 손상과 전립선 상피 세포에서 세포사멸에 주는 효과를 평가하기 위해서 개를 이용한 동물실험을 하였다. 성적으로 완전한 성견을 셀레니움-무첨가(대조군)와 첨가(처리군) 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 처리군은 세레노메치오닌이나 셀레니움 고함유 이스트 일일 3 ㎍/kg.체중과 6 ㎍/kg.체중씩 7개월 동안 투여했다.
  • 전립선 세포와 말초혈액 림프구의 DNA 손상 정도가 대조군에 비해서 셀레니움 투여군에서 더 낮은 결과를 보였으나 항산화 효소인 glutathione peroxidase의 활성과는 관련이 없었다. 세포사멸을 나타내는 dUTP에 표지되는 전립선 세포의 평균숫자는 셀레니움 투여군이 3.7, 대조군은 1.7이었다. 식이 셀레니움 이온의 보충이 DNA 손상을 감소시키고 노화된 개의 전립선 상피세포의 세포사멸을 증가시켰다.
  • 셀레니움 이온의 용량과 형태는 암 예방의 중요한 요소이다. 다른 셀레니움 이온들은 전립선암에서 다른 효과를 보일 수 있다. Gasparaian A.V. 등(48)은 두 가지 형태의 셀레니움 이온 (sodium selenite, MeSeA)이 DU145와 JCA1 전립선 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사멸을 유발함을 밝혔다. 세포사멸을 유발하는 농도에서, 이들은 DU145와 JCA1 전립선암 세포에서 TNFa와 lipopolysacchride에 의해 유도되는 NF-kB DNA 결합을 저해했다. 게다가 sodium selenite와 MeSeA는 전립선 암세포에서 IkB kinase 활성을 저해하고, 전립선암 세포에서 TNF-α와 지질다당류 의해 유도되는 IkB-α 인산화와 분해를 억제하였다.
  • IkB-α d.n 변이주에 의해 NF-kB의 억제로 셀레니움 화합물에 의해 전립선암 세포가 쉽게 세포사멸에 이르도록 변하는 결과를 초래했다. 이러한 결과는 셀레니움이 전립선암을 치료하는데 적어도 NF-kB 활성화 경로를 한 타겟으로 한다는 것을 말해준다.
  • Menter D. G. 등(49)은 정상적인 1차 전립선 세포들(표피세포,기질세포, 평활근 세포)과 전립선암 세포주(LNCaP, PC-3, DU145)를 배양하여 셀레니움 이온이 일차배양과 비부착 증식에서 미치는 영향을 조사했다. 정상세포와 비교해서 1-500 mM의 Na2SeO3 또는 SeMet를 처리한 암세포에서는 농도의존적 성장 저해와 세포사멸이 관찰되었다. 모든 농도에서 Na2SeO3가 더 강한 성장 저해를 보였다.
  • 안드로젠에 반응하는 LNCaP 세포의 성장 저해가 셀레니움에 가장 많은 영향을 받았다. 정상적인 일차 전립선 세포의 성장은 거의 억제되지 않았다. 또한 셀레니움 처리한 세포에서 DNA 응축과 절단이 증가되었고, caspase 3가 방사성 형광표지된 세포에 함께 나타났다. 정상세포와 비교하여, 높은 수준의 PARP(poly ADP-ribose polymerase)의 발현과 PARP 절단이 암세포의 세포사멸동안 관찰되었다. PI 염색법과 FACS 분석에서 선택적인 암세포의 사멸은 sub G0-G1 세포의 증가와 관련이 있었다.
  • SeMet는 암세포를 선택적으로 세포주기 G2-M으로 정지시켰다. SeMet에 의한 암세포 성장의 저해는 G2M 단계로 세포 성장이 정지되는 cdc2의 인산화와 관련이 있다. 한천 배지에서 비부착성 증식을 하는 전립선암 세포는 셀레니움 이온에 민감하다. Cho S. D. 등(50)은 항암 효과가 있는 활성 셀레니움 대사물질 methylselenol이나 그 전구체인 methylseleninic acid (MSeA)가 안드로젠에 반응하는 LNCaP 전립선 암세포 모델에서 특히 PSA발현을 저해하는지 조사하였다. MSeA와 methylselenol은 세포사멸 농도 이하에서 PSA 단백질의 발현과 분비를 저해했으나 반면에 sodium selenite와 selenomethionine은 저해 효과가 없었다. Jiang C. 등(51)은 MSeA에 의해 유도된 DU-145 전립선 암세포의 사멸에서 이러한 분자의 연관성을 시험하였다.
  • 유전독성이 있는 셀레니움 중 대표적인 sodium selenite가 비교 물질로 사용되었다. MSeA에 의해 유도된 세포사멸은 여러 caspase(caspase-3, -7, -8, -9)의 활성화와 미토콘드리아에서 cytochrome c의 분비, PARP 절단, DNA 절단을 수반하였다. 반대로 selenite에 의해 유도된 세포사멸성 DNA 절단은 이러한 변화 없이도 일어 났다. 그러나 c-Jun-N-terminal kinase 1/2, p38 MAP kinase/ SAPK2의 인산화는 연계되어 있었다.
  • 일반적인 caspase 저해제 benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone은 MSeA에 의한 procaspase와 PARP의 절단, CC 분비, DNA nucleosomal fragmentat이온을 저해하였으나 세포의 박리는 막지 않았다. 또한 PARP 절단과 caspase 활성화는 전적으로 박리된 세포에 한정되었는데, 이는 caspase 활성화와 세포사멸이 일어나기 MseA에 의해 세포의 박리가 유도되어야 함을 의미한다. 따라서 이러한 과정은 세포 밖 메트릭스와의 접촉 손실에 의해 촉발되는 세포사멸의 일종인 “anoikis”와 유사하다. 비가역적 caspase 저해제를 이용한 추가적인 실험에서 MSeA에 의해 유발된 anoikis에는 caspase-3, 7에 의한 PARP 절단이 일어났는데 이는 caspase-8에 의해 유도되고, CC-caspase 9의 활성과 caspase-3의 feedback 경로에 의해 증폭된다고 생각된다.
  • 종합하면, 메칠 셀레니움이 DU 145의 세포사멸을 일으키기 위해서는 먼저 세포의 박리(anikosis)가 필요하고, 근본적으로 caspase-8의 활성화와 복합적인 caspase들 간의 신호전달에 의해 이루어 진다고 볼 수 있다. Wang Z. 등(52)의 연구에서, DU145 전립선 암 세포에서의 세포사멸 활동과 methylselenol이 사람의 탯줄 혈관 내피 세포(HUVEC)에 G1 정지를 일으키는지 시험하였다.
  • DU145 세포에 methylselenol을 처리하면 mMol 범위에서는 caspase에 의한 PARP의 분해, DNA 절단, 형태적인 세포사멸이 발생하였고, MseA에 의해 단백질 인산화효소인 AKT와 ERK1/2의 인산화 저해와 같은 유사한 생화학적 현상들이 나타났다. HUVEC 세포에서 methylselenol 노출은 G1 중간부에서 G1 후반부까지의 과정에서 mitogen에 의한 G1 정지 활동을 반복하였다. 이러한 단계적 특이성은 PI3K의 저해제에서도 나타난다. 이 결과는 methylselenol이 caspase에 의한 세포사멸과 G1 정지를 야기시키는 셀레니움 대사산물임을 보여준다.
  • Jiang. C. 등(53)은 표적인 hydrogen selenide 대사 산물인 sodium selenite와 비교하여, 새로운 MeSe의 전구체인 MseA의 효과를 사람 전립선 암 세포 DU145에서의 세포사멸의 진행, 세포주기의 분포, 특정 protease kinase에서 조사하였다. DU145 세포에 3uM의 MseA를 가하면 24시간째에 G1 정지가 일어나고, 높은 농도에서는 G1 정지뿐 아니라 세포사멸의 두 가지 대표적인 특징인 DNA 절단과 caspase에 의한 PARP 분해가 일어난다.
  • Immunoblot 분석결과 의 세포사멸 농도 이하의 MSeA에서 일어나는 G1 정지는 p27Kip1, p21cip1의 발현의 증가와 연관되어 있지만, 세포사멸은 p38MAPK와 JNK1/2의 인산화의 변화 없이 AKT와 ERK1/2의 인산화의 농도 의존적 감소를 수반하였다. 반대로 selenite는 S기의 정지와 caspase와 관련없는 세포사멸 DNA 절단 일으켰는데, 이것은 p27kip1, p21cip1 발현의 감소와 AKT, JNK1/2, p38MAPK의 인산화의 증가와 관련이 있었다. MSeA에 의한 세포사멸 유발이 세포 배양 배지에 첨가한 SOD에 민감하지 않았지만 selenite에 의한 세포 탈착과 DNA 절단은 이 효소에 의해 매우 감소되었다는 것은 이 과정에 있어 superoxide가 연관되어 있다는 것을 시사한다. MSeA 노출 세포에서 PARP 분해가 일어나기 전 AKT와 ERK1/2의 탈인산화 변화는 일시적인 관계가 있음에도 불구하고, PI3K의 저해제인 wortmanin과 LY294002를 사용한 실험에서 MseA에 의한 PARP의 절단에서 AKT의 특이적 저해가 증가되지 않았다.
  • 이 결과들로 볼 때 DU145세포에 MseA 또는 selenite를 처리하면 각기 다른 형태로 AKT, ERK1/2, JNK1/2, p38MAPK 인산화, p21, p27의 발현뿐 아니라 세포주기 정지와 세포사멸이 일어났다. 화학적 암 예방을 위해서 셀레니움 대사 물질들은 여러 단계의 분자경로에서 다양하게 작용하고 있다. Dong Y. 등(54)은 PC-3 전립선 암 세포에서 MSA의 분자세포학적 효과를 조사하였다. MSA를 생리적 농로로 처리하면, 세포들은 농도와 시간에 따른 성장저해를 보였다. MSA는 세포주기의 각 단계의 세포비율은 변화시키지 않고 여러 변환점에서 주기를 늦추었다. 많은 연구자들이 혈청의 셀레니움 이온의 수준이 전립선 암을 진단할 수 있는 중요한 marker임을 증명하였다.
  • Fig. 4. Prostatic epithelial cell apoptosis in control dogs and dogs receiving daily selenium supplementation[47]. A modified terminal deoxynucleotidyl transferase?mediated dUTP nick end-labeling (TUNEL) method was used to measure prostatic epithelial cell apoptosis in situ in formalin-fixed tissue specimens (22). For each dog, the number of prostate epithelial cells with positive nuclear staining was counted in randomly selected, noncontiguous, x200 microscopic fields. An average of 23 fields in one tissue section was evaluated for each dog. Immunopositive stromal cells, inflammatory cells, or epithelial cells that were shed into the acinar lumen were not counted. Microscopic fields that contained areas that displayed intense inflammation were not scored.
  • A) Data are displayed in a box and whisker plot (prostate tissue from one selenium-supplemented dog did not react to staining). The center horizontal line indicates the median value for each group. The length of each box (interquartile range) indicates the range of the central 50% of values, with the box edges placed at the first and third quartiles. Whiskers (the lines extending beyond the box) show the range of observed values that are within 1.5 times the interquartile range. Panels B, C, and D) Representative photomicrographs of TUNEL-stained prostate tissue from a control dog (B) and a selenium-treated dog (C) demonstrate the increased number of epithelial cells with TUNEL-positive nuclear staining (brown) associated with selenium treatment. Panel D shows a region of markedly increased apoptosis ("hot spot") within the prostate of a selenium-treated dog. In each of these x200 photomicrographs, the scale bar = 50 μm.
  • 2. 전립선암에 있어 녹차의 화학예방 효과
  • 세포배양과 동물 모델에서 수행된 많은 연구에서 녹차와, 그 성분 폴리페놀이 전립선암에 유용하다는 사실이 알려졌다. 그 가능성에 대한 역학적 근거는 두 가지로 볼 수 있다. 첫째, 몇몇 역학적 연구에서 꾸준히 차를 음용 하는 사람들은 전립선암에 의한 사망률이 더 낮다.
  • 둘째, 매일 녹차를 마시는 중국인들은 전립선암의 발생률이 전세계에서 가장 낮다. 녹차의 소비와 전립선암의 원인학적 관계를 규명하기 위해서 southeast China의 Hangzhou 에 있는 Jian L. 등(55)은 2001-2002년에 case-control 연구를 수행했다. 녹차를 마시는 횟수와 음용 기간, 마시는 양이 증가할수록 전립선암의 감소하였다.
  • 차를 마시지 않는 사람에 비해서 티를 마시는 사람의 경우 교차비(OR; odd ratio)는 0.28(95% CI=0.17-0.47), 40년간 마신 사람의 경우 0.12(95%CI=0.06-0.26), 매년 1.5kg 이상의 차를 마시는 사람의 경우 0.09(95% CI=0.04-0.21), 매일 3 컵 이상의 차를 마시는 사람의 경우 0.27(95%CI=0.15-0.48)이었다. 이와 같이 차를 마시는 양과 그 효과의 상관관계가 뚜렷하였으며, 이는 녹차가 전립선암을 예방하는데 효과적임을 보여준다.
  • 세포사멸의 유도는 녹차가 전립선암의 성장을 억제하는 중요한 메커니즘 중 하나다. Lyn-Cook B. D. 등(56)은 in vitro 상에서 녹차와 홍차의 추출물과 그 성분들이 전립선 암세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 녹차 폴리페놀(녹차 폴리페놀), 홍차 폴리페놀(BTP), 홍차 theaflavins(TF)과 정제된 ECG(epi카테킨-3-gallate)와 EGCG(epigallo카테킨-3-galolate)가 사용되었다. 전립선 암세포(LNCaP)에 이들 물질을 24시간 처리하였다.
  • 홍차와 녹차는 전립선암 세포의 성장을 억제하였다. 녹차추출물녹차 폴리페놀)과 theaflavins(TF) 역시 현격한 성장억제를 하였으며, ECG와 EGCG 역시 성장억제를 하였다.
  • 녹차추출물과 홍차추출물, EGCG 는 RT-PCR 결과 모두 K-ras 유전자의 발현을 감소시켰다. 녹차추출물과 홍차추출물은 mdr-1(multidrug-resistant gene)의 발현을 감소시킨 반면, 녹차 폴리페놀와 EGCG는 증가시켰다. Paschka A. G.(57)의 연구에서, 녹차의 성분들을 전립선암 세포인 LNCaP, PC-3, DU145등에 처리하였다.
  • 이중 EGCG가 세포성장을 억제하는 가장 강력한 카테킨 이었다. EGCG에 의한 세포증식 억제는 핵의 형태와 DNA 절단으로 보아서 세포사멸에 의해 세포가 죽기 때문 이였다. 이는 EGCG가 녹차에 들어있는 활성성분으로, 사람의 전립선암 세포에 세포사멸을 일으킨다는 최초의 증거가 된다.
  • Chung L. Y. 등(58)은 녹차의 추출물성분(TE) 중에 불활성인 EC를 제외하고, 녹차 추출물(GTE)과 다른 세가지 녹차 카테킨들은 주로 활성 산소종의 증가와 mitochondria의 depolarization을 통해서 사람 전립선염 세포주인 DU145의 증식을 억제하고 세포사멸을 촉진하였다.
  • 이런 결론은 서로 다른 녹차 카테킨을 조합하여 세포성장 억제, 세포사멸의 유도, 활성산소(ROS)의 형성, 그리고 mitochondria의 depolarization에 대한 활성을 조사하였을 때, ECG>EGCG>EGC>E의 순으로 나타나는 것으로 뒷받침 된다. 녹차 카테킨에 의한 세포사멸 유도에 관한 분자수준의 메커니즘에 대해서는 아직 명확치 않으나, DU145 세포주에서 EGCG의 처리가 bcl-2, bcl-X(L), BAD등의 발현을 변화시키지 않는 것으로 보아, bcl-2 family와는 무관한 것으로 보인다.
  • 많은 연구자들은 카테킨이 세포신호전달과 세포주기를 조절함으로써 전립선암의 세포사멸을 유도한다고 밝히고 있다. Gupta S. 등(59)의 연구에 의하면, EGCG에 의한 세포주기의 조절상실과 세포사멸은 CKI-CDK에 의한 신호 전달 기작을 통해 일어난다.
  • Immunoblot 분석결과, LNCap, DU145 세포에 EGCG를 처리하면, 현저하고 농도와 시간에 따른 1)WAF1/p21, KIP1/p27, INK4a/p16, INK4c/p18등의 단백질 양의 증가, 2)cyclin D1, E, cdk2,4,6(cyclin D2를 제외한)등의 단백질 양 증가, 3) p21과 p27에 대한 cyclin D1의 결합 증가, 4) cyclin E와 cdk2의 결합감소 현상을 보였다. 결론적으로, EGCG는 G1 phase ckis를 유도하는데, 이는 세포 주기의 G0/G1에서 필요한 cyclin-cdk를 억제하여, 세포주기의 정지를 일으켜, 궁극적으로 세포사멸에 의해 세포가 죽는 비가역적 과정이다. 이는 EGCG가 사람 전립선암 세포의 세포 주기의 정지와 세포사멸을 일으키기 위해서 cdk inhibitor-cyclin-cdk 의 신호전달과정의 각 성분들이 어떻게 작용하는지에 대한 최초의 체계적 연구이다.
  • Gupta S. 연구진(60)에 의한 또 다른 결과에서, 녹차의 주요 폴레페놀 성분인 EGCG는 안드로젠에 반응하거나, 반응하지 않는 사람의 전립선암 세포 모두에 대해 증식을 억제하였다. 이 경우 역시 세포주기의 조절상실과 세포사멸의 유도를 통해 일어난다.
  • EGCG를 처리하여 DNA-세포주기를 분석하면, 두 가지 세포 모두에 농도에 비례하여 G0/G1 정지가 일어난다. DNA ladder 분석, confoal microscopy, 그리고 flow cytometry를 통해, DU145와 LNCaP를 EGCG로 처리한 결과 농도에 비례하여 세포사멸이 일어나는 것을 알 수 있었다. Western blot 분석에서, EGCG를 처리하면 1)LNCaP 세포(wild type의 p53을 발현)는 농도에 비례하여 p53이 증가하였고 DU145 세포(mutant p53을 발현)의 경우 그렇지 않았다, 2) 두 세포 모두에서 CKI의 하나인 p21이 증가되었는데, 이는 EGCG가 세포사멸을 유도할뿐더러, mitogenesis를 조절하여 전립선암 세포의 성장을 억제 조절한다는 것을 시사한다. 이것은 세포내의 안드로젠이나 p53의 상태와는 관계없이, p21에 의한 G0/G1 정지에 의해 세포 특이적으로 일어난 듯 하다.
  • Hastak K. 등은 사람 전립선암 LNCaP 세포에서 EGCG에 의한 세포사멸이 두 개의 관련된 경로의 변화에 의해 일어난다고 보고하였다: a) 특정 세린 잔기의 인산화에 의한 p53의 안정화와, p14에 의한 MDM2(murine double minute 2)의 감소조절, b)NF-kB의 억제를 통한 bcl-2(a proapoptotic protein) 발현의 감소. EGCG에 의한 p53의 안정화는 그 전사활동을 증가시킴으로, 신호전달단계 밑에 위치한 p21과 Bax를 증가시키게 된다. 이처럼, EGCG는 두 개의 중요한 전사인자인 p53과 NF-kB에 영향을 주어, 동시에 Bax/Bcl-2 비율을 세포사멸이 일어나는 쪽으로 변화시키는 작용을 한다. 이처럼 bcl-2 family의 발현이 변화함에 따라 선도인자 caspase9와 8이 활성화되고 이어 효과인자 caspase3가 활성화된다.
  • caspases가 활성화 되면, poly(ADP-ribose) polymerase 절단이 일어나고 세포사멸이 유도된다. 이 데이터는 EGCG가 사람 전립선암 세포에서 세포사멸의 촉진/억제 단백질들의 균형상태를 세포사멸이 잘 일어나는 상태로 변화시킨다는 것을 시사하고 있다.
  • Gupta. S등은 EGCG에 의해서 NF-kB가 감소하는 데는 caspases가 매우 중요한 역할을 하고 있음을 보여주었다. Siddiqui I. A. 등(61)은 사람 전립선암 세포에 차 폴리페놀을 처리하여 따른 PI3K/PKB(phosphatidylinonsitol 3 kinase/ protein kinase B), MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로의 변화를 연구하였다.
  • 두 개의 서로 다른 사람 전립선암 세포주 DU145와 LNCaP를 사용, Western blot 분석을 통해, EGCG와 theaflavin이 PI3K/PKB와 MAPK 경로에 미치는 영향을 조사했다. EGCG와 theaflavin 모두 두 세포 모두에서 1)PI3K와 phospho-Akt를 감소시켰으며, 2) Erk1/2를 증가 시켰다. 이 연구는 목표를 한 만큼, PI3K의 기본수준과 Akt의 인산화 억제가 중요함을 보여주고 있으며, Erk1/2가 EGCG와 theaflvin의 항암 작용관 관련 있음을 시사한다.
  • Wang S. I. 등(62)은 에 EGCG를 처리하여 유전자 발현을 조사했다. cDNA microarray를 이용하여 EGCG가 사람 전립선암 세포 LNCaP에서 어떻게 유전자 발현 프로그램을 변화시키는지 밝혔다. 형광 표지된 cDNA 탐침은 EGCG를 12시간동안 처리하거나, 처리하지 세포로부터 합성하였고, 생리활성적으로 효과를 얻을 수 있는 농도를 총 250가지의 kinase와 phosphatases 유전자가 포함되어있는 microarray에 완전히 hybridization시켰다. 이러한 고처리 선별법에 의해 EGCG에 반응하는 여러 유전자 후보를 선정하였다. EGCG는 일련의 유전자들을 유도하여 기능적으로 세포성장의 억제를 유도하였다.
  • EGCG에 의해 억제되는 유전자는 대부분 G-protein signaling 경로에 속해있었다. 흥미롭게도, 몇몇 암 세포에서 성장억제에 관련되었다고 알려진 PKC-α는 일곱 개의 PKC isoforms 중에서 유일하게 EGCG에 의해서 감소되었다. 이런 EGCG에 반응하는 유전자들은 전립선암의 화학적방어에 있어 폴리페놀 화합물들의 작용 메커니즘에 대한 중요한 통찰을 제공한다. Fang M. Z. 등(63)은 EGCG가 전립선 암 세포에서 DNA methyltrasferase를 억제하고 methylation에 의해 불활성된 된 유전자들을 재활성화 시킨다는 것을 발견했다. Clusterin(CLU) 단백질은 동물조직에 널리 분포되어 있으며, 세포사멸과 신생물 형성을 포함하여 여러 가지 다른 과정에 관여한다.
  • 카테킨은 자연발생적으로 전립선 암이 발생하는 TRAMP(transgenic adenocarcinoma mouse prostate) 마우스를 위시한 많은 동물 암세포 모델에서 화학적인 암 예방작용을 하는 것으로 알려져 있다. Caporali A. 등(64)은 녹차 카테킨 주성분인 EGCG가 정상적인 사람 전립선 상피세포에는 변화를 주지않았으나, 미분화 전립선 암 세포(PC-3)뿐 아니라 SV40- 불멸화 사람 전립선 세포(PNT1A)의 성장을 강력하게 억제하였다고 보고했다.
  • IC50 농도의EGCG를 24시간동안 처리하면, 두 가지 세포주에서는 caspase 경로가 활성화 되고, CLU 단백질의 축적되지만, 정상 세포에서는 그렇지 않고 CLU의 양이 검출되지 않는다. TRAMP 마우스는 100% 전립선암이 발생한 반면, 음료에 0.3%의 투여한 경우에는 제공받은 경우에는 20%만이 암이 발생되었다.
  • TRAP 마우스에는 전립선암의 발생과 진행단계에서 GLU 유전자가 급격하게 감소 조절되었다. 녹차 카테킨에 의해 암세포 형성이 억제된 TRAMP 마우스에서는, CLU mRNA와 단백질이 점차적으로 전립선 내에 축적되었다. 녹차 카테킨에 의해 암의 방지에 실패하여 전립선암이 발생된 동물에는 CLU가 검출되지 않는 정도로 감소되었다.
  • 이처럼 전립선암이 발생한 TRAMP 마우스에서는 histone3(H3)가 증가되고, 성장 중단 관련 유전자 Gas1가 감소하였다. 반대로 녹차 카테킨 처리로 암 발생이 저해된 마우스에서는 전자가 감소하고 후자가 증가하는 양상을 보였다. 녹차 카테킨에 의해 암 예방이 실패하는 경우 H3와 Gas-1모두가 유도되었으며, CLU의 레벨은 감소했다. 면역 조직학적 실험을 통해서 전립선암이 진행되고 있는 동안에는 CLU가 감소하고 있으며, 녹차 폴리페놀을 처리된 TRAMP 마우스에서는 반대로 증가한다는 것이 확인되었다. 따라서 CLU가 전립선 암의 억제에 있어 중요한 새로운 암 억제 유전자라는 의견이 제시되었다.
  • 나아가, Vaquar M. A. 등(65)은 최근 TRAMP 마우스의 전립선암에서 신생혈관형성에 관련된 VEGF(vascular endothelial growth factor)같은 유전자와 전이에 관계하는 MMP-2/9(matrix metalloproteinases)같은 유전자들의 발현이 증가되고 있음을 관찰하였다. TRAMP 마우스에게 녹차 폴리페놀을 유일한 음료로 투여하면 이들 VEGF, MMP-2/9이 현저하게 억제되었다. 이런 연구들은 녹차에 의한 전립선암의 화학적 예방이 여러 목표에 의해 이루어지며, 전립선암의 예방과 치료를 위해서 녹차와 그 폴리페놀 성분에 의해 조절되는 새로운 경로를 밝힐 수 있는 더 많은 심도 있는 연구의 필요성을 제시하고 있다.
  • 폴리아민의 생합성 과정에서 속도를 결정하는 효소인 Orinithin decarboxylase(ODC)는 전립선 암세포 혹은 전립선 암이 있는 사람의 체액에서 과잉발현 되고있음이 관찰되었다. ODC는 안드로젠에 반응하는 유전자의 하나로써, 안드로젠으로 자극을 주면 정상적인 전립선 세포와 전립선암 세포 모두에서 세포의 발생과 성장을 조절한다. 따라서 OCD유전자의 조절을 통해서 화학적 예방을 하려는 시도는 전립선암에 매우 효과적일 수 있다.
  • Gupta S. 등(66)은 사람 전립선암 세포 인 LNCaP를 이용한 in vitro 모델과 Cpb:WU rats 그리고 C57BL/6 mice를 이용한 in vivo 모델을 이용하여, 녹차 폴리페놀이 테스토스테론에 의한 OCD의 유도작용을 억제하는 효과가 있는지 조사했다. LNCaP를 testosterone으로 처리하면 ODC 활성이 농도에 비례하여 유도되었다.
  • 세포에 녹차 폴리페놀을 사전 처리하면 테스토스테론에 의한 ODC 활성의 유도가 역시 농도에 비례하여 억제되었다. LNCaP의 비부착성 성장 assay에서도, 세포에 녹차 폴리페놀을 사전 처리하면 마찬가지로 colony의 형성이 농도에 비례하여 감소되었다.
  • 세포에 테스토스테론을 처리하면 OCD mRNA 수준이 현저하게 증가되는데, 녹차 폴리페놀을 전처리 하면 그 효과가 거의 완전히 사라졌다. 거짓 수술하였거나 거세한 Cpb:WU rat에 테스토스테론을 처리하면 복부 전립선의 ODC 활성이 각각 2배와 38배 증가했다. 테스토스테론 처리 전 7일간 음료중에 약 0.3%의 녹차 폴리페놀을 투여하면 테스토스테론에 의한 ODC 활성의 억유도가 각각 20% 와 54% 감소하였다. C57BL/6 마우스에서도 유사한 결과가 관찰되었는데, 같은 농도의 테스토스테론 처리에 복부 전립선의 ODC 활성이 2배 증가하였는데, 0.2%의 녹차 폴리페놀을 사전 처리하면 이러한 유도가 40%정도 억제되었다.
  • 또한 EGCG는, 완전한 세포에서 지방산의 합성을 억제하는 강력한 천연 억제제로, 전립선 암 세포에서 선택적으로 세포사멸을 유도하였다. 지방산 합성효소(FAS)의 화학적 억제제는 몇몇 암세포에서 행한 in vitro 실험과 암세포이식을 통한 in vivo 실험에서, 세포의 성장을 저해하고 세포사멸을 유도한다. 최근 EGCG가 닭의 간 추출물에서 FAS를 억제하는 천연 억제제로 알려졌다. Brusselmans K. 등(67)은 EGCG가 배양한 전립선 암 세포에서 FAS의 활성을 억제하는지, 또한 이러한 억제가 어떻게 체내의 지방 합성, 세포 성장, 세포사멸 등에 영향을 주는지 연구했다.
  • LnCaP 세포의 높은 FAS 활성이 EGCG에 의해 억제되고, 병행하여 내부 지방 합성이 감소되며, 세포성장이 억제되고, 세포사멸이 유도되었다. 반면, 녹차의 폴리페놀 성분 중 매우 유사한 또 다른 폴리페놀 EC(epi카테킨)는 FAS를 억제하지 않고, LNCaP 세포의 성장이나 생존에 아무런 영향을 주지 않았다. FAS 활성이 낮은 비종양 세포에 EGCG를 처리하면 세포성장 속도는 감소하나 세포사멸은 유도되지 않았다.
  • 수치와 유사하다. 이 결과는 EGCG는 LnCaP세포에서는 기존에 알려진 합성 저해제와 같이 효과적으로 FAS 의 활성을 억제하고 선택적으로 세포사멸을 유도하지만, 비종양 fibroblast에는 영향을 주지 않는다는 점을 시사한다. 이런 연구결과는 EGCG가 강력한 천연 FAS 억제제이며, 이를 화학적 암 예방과 암 치료제로 이용할 수 있다는 분자생물학적 근거를 확고히 해준다.
  • 전립선 특이 항원 PSA는 세린-protease로서, 요도응혈(seminal coagulum)에서 semenogelins을 분해할 뿐 아니라, 세포외 matrix glycoprotein을 분해하여, 세포의 이동과 전이에 영향을 줄 수 있다. Pezzato E. 등(68)은 EGCG가 전립선 암에서 PSA의 발현과 활성에 어떤 영향을 주는지에 조사하였다. EGCG는 PSA 발현에 대한 일종의 억제장치이며, 농도에 비례하여 위의 PSA 활성을 억제하였다.
  • 이런 억제는 세포독성 세린-protease 억제제인 PMSF보다 낮은 농도에서 나타났는데 이는 녹차의 섭취 후 혈청에서 측정한 에 해당한다.
  • PSA의 활성은 imflammatory leukocyte에서 분비되는 elastase에 의해서도 역시 억제된다. 이런 결과는 PSA의 또 다른 활성을 조명하여, gelatin zymography가 PSA의 편리한 assay로 이용할 수 있으며. EGCG가 전립선암 악화에 대한 천연 억제제로 사용될 수 있음을 제시하고 있다. 또한 전립선의 염증반응에 대한 앞으로의 연구가 기대된다.
  • 동물실험과 임상실험에서 녹차가 전립선암의 화학적 암 예방에 효과가 있음이 증명되었다.
  • Liao S. 등(69)은 전립선암의 성장에 미치는 EGCG의 효능을 in vivo에서 조사하였다.
  • 사람 전립선암 세포주 PC-3와 LNCaP를 누드 마우스의 피부에 접종하여 전립선암이 생기도록 하였다. 녹차의 EGCG를 복강주사하면 누드 마우스에 생긴 사람 전립선암의 성장이 억제되고, 암의 크기도 빠르게 줄어들었다. 그러나 구조적으로 유사한 EG와 같은 카테킨은 효과가 없었다. male TRAMP 마우스를 이용한, Gupta S. 등(70)의 연구에서는, 사람에게는 하루에 6잔의 녹차에 해당하는 양의 녹차 폴리페놀을 누드 마우스의 구강을 통해 주입했더니 전립선암의 발달이 억제되었고 그 결과 이들 마우스의 생존이 증가하였다.
  • 놀랍게도 녹차 폴리페놀은 다른 조직으로 전이된 암도 거의 완벽하게 억제하였다. 더욱이 녹차 폴리페놀 섭취로 현저한 전립선 암 세포의 사멸이 일어났고, 그 결과 암세포의 전파가 크게 감소되었고, 전립선암의 발달, 진행, 다른 기관으로의 전이가 억제되었다. Jatoi A. 등(71)은 안드로젠 비의존적 전이성 전립선암을 앓고 있는 환자를 대상으로 녹차의 효능에 대한 임상 II 단계 실험을 하였다.
  • 한 환자에게서 PSA 기본수치가 감소했는데, 이는 코호트 분석(95%의 신뢰범위, 1-14%)에서 전체의 2%에 해당하는 수치이다. 이와 같은 한 경우의 반응은 2개월 넘게 지속되지는 않았다. 첫째 달의 마즈막, 코호트 분석에 의한 PSA 기본수치의 평균 변화율은 전체 실험군의 43%가 증가했다.
  • 녹차의 독성은 보통 grade 1~2정도로 환자 69 %에서 나타났다. 증상은 구역질, 구토, 불면, 피곤, 설사, 복통. 혼미 등이다. 그러나, 독성 Grade 3 중 6건, 독성 Grade 4 중 심각한 혼미 1건이 일어났다. 이처럼, 녹차는 안드로젠 비의존적 전립선암을 가진 환자에게는 PSA 수치의 감소로 보아 제한된 항암 작용을 가지고 있다.
  • 사람에 있어서 5-α-reductase 활성은 남성의 성적 분화 측면에서 중요하며, 양성 전립선 과다형성, 탈모증, 다모증과 전립선암과 관련이 있다. 5-α-reductase는 전립선 암의 진행에서 중요한 기능을 하며, 전립선 암의 성장을 억제하는 녹차 폴리페놀의 표적이 된다.
  • Hiipakka R. A. 등(72)은 폴리페놀에 의한 사람 5-α-reductase의 억제에 대해 구조-활성에 관한 관계를 조사하였다. EGCG는 cell-free에서는 강력한 5-α-reductase의 억제를 보였으나, whole-cell assay에서는 그렇지 못하였다. EGCG의 gallate ester를 long-chain fatty acids로 치환하면, cell-free와 whole-cell assay 모두에서 강력한 5-α-reductase 억제를 보인다. 다른 몇몇 천연 또는 합성 폴리페놀 성분들은 type2 isozyme에 비해 type 1을 보다 효과적으로 억제하였는데, 여기에는 alizarin, anthraobin, gossypol, nordihydroguaiaretic acids, caffeic acid henethyl ester, octyl gallates, 그리고 docecyl gallates등이 있다. Catechol group의 존재가 5-α-reductase type1 isozyme에 대해 특이성을 보인 거의 모든 억제제의 특성이었다.
  • 3. 전립선 암에서 금속 이온과 반응하는 카테킨의 효과
  • 3.1 금속 이온의 흡수에 있어서 카테킨의 효과
  • Coudray C. 등(73)은 어떤 종류의 폴리페놀이 아연 이온과 구리 이온의 흡수에 영향을 주는 지를 쥐에서 실험하였다. 영양학적으로 흥미있는 여러 폴리페놀(chlorogenic acid, caffeic aid, 카테킨, rutin)을 안정한 동위원소 아연67 과 구리65로 표지한 사료를 투여하였다. chlorogenic acid나 caffeic acid를 먹인 쥐는 다른 대조군에 비해서 현저하게 아연의 흡수가 낮았다. 카테킨 섭취는 아연의 흡수를 크게 저해하지 않았다. 그러나 구리 이온의 흡수는 고려하지 않았다. 이 연구는 금속과 결합하는 페놀 화합물이 쥐의 미네랄 영양에 어떤 영향을 보이는지, 또한 이러한 성분이 풍부한 여러 식품이 사람의 미네랄 흡수에도 중요할 수 있다는 것을 보여준다.
  • Kuo S. M. 등(74)은 구조적으로 다양한 식이 플라보노이드와 미량 금속이온과의 상호작용과 식이 플라보노이드가 장내 세포에 미치는 영향을 체계적으로 조사하였다. Quercetin, rutin, kaempferol, flavanol 그리고 카테킨 등의 flavonol family는 구리이온(II)이나 철이온(III)과 반응하는 것으로 밝혀졌다. 노출시간이 길어지면, quercetin은 망간 이온(II)과도 반응하였다. Quercein과 구리 이온(II)이 1:1로 존재할 때, 구리에 의한 hematoxylin의 발색이 완전 차단되었다.
  • 사람의 장 세포인 Caco-2의 배지에 quercetin을 넣어주면, 금속 결합 항산화 단백질인 metallothionein의 수치가 감소하였다. Quercetin의 metallothionein에 대한 반응은 농도와 시간에 비례하였다. 반대로, genistein과 biochanin A는 metallothionein의 수치를 증가시켰다. 식이 플라보노이드와 미량 금속과의 반응과 metallothionein 수치에 대한 플라보노이드의 효과로 보아 플라보노이드는 이온 항상성과, 세포의 산화 상태에 구조 특이적으로 영향을 미칠 수 있다. Kang W. S. 등(75)은 녹차 카테킨의 항혈소판 작용은 세포질 내 칼슘 이온 증가를 저해함으로 이루어진다고 밝혔다.
  • Brune M. 등(76)은 철 이온 흡수와 폴리페놀 구조와의 관계를 연구하였다. 페놀 화합물 (페놀성 모노머, 폴리페놀, 탄닌)은 소화기 내에서 철 이온과 복합물을 형성하여 철 이온의 흡수를 방해할 것이라고 여겨왔다. 다른 크기와 다른 화학 구조의 페놀 화합물의 어느 정도까지 철 이온 흡수를 저해하는지는 거의 밝혀지지 않았다. 철 이온 흡수와 페놀 화합물의 종류와 양과의 관계를 외인 표지(extrinsic tag) 방법으로 연구하였다.
  • 탄닌산에 의한 철 이온 흡수의 저해는 농도 밀접한 관계를 가진다. Gallic acid도 탄닌산와 같은 정도로(/mol galloyl group) 철 이온의 흡수를 저해한 반면, 반면, 음식에 카테킨을 넣어주었을 때는, 아무런 저해가 보이지 않았다. Chlorogenic acid는 철 이온의 흡수를 덜 저해하였다. 오레가노와 차는 galloyl groups의 정도에 따라 비례적으로 철 이온 흡수를 저해하였으나, 시금치의 저해효과는 훨씬 적었다. 커피의 저해 효과는 주로 galloyl groups의 함량으로 설명할 수 있으나, 아마도 chlorogenic acid와 같은 다른 성분에 의해서도 영향을 받으리라 추정된다. 결론적으로, 페놀 화합물이 음식물로부터 철 이온의 흡수를 저해하는 데는 철과 결합하는 galloyl groups의 함량에 의해 주로 결정되며, 카테콜 group은 부수적인 영향만을 준다.
  • 녹차가 금속이온의 흡수를 억제하여 그 독성을 약화시킨다는 것은 몇몇 질병의 화학적 예방의 중요한 메커니즘이 될 수 있다. Blache D. 등(77)의 연구에서, (+)-카테킨 (Cat), 코코아, 그리고 적포도주가 급성 철분 축적에 의한 혈소판 과민 모델에서의 어떤 영향을 주는지 조사되었다. 혈소판의 기능이 철이 축적된 쥐에서 현저하게 증가되었다. 이러한 변화는 ex-vivo에서 자유 라디칼에 의한 용혈을 포함하여 항산화 방어의 결함과 관계가 있었다. 카테킨을 전처리하면 항산화 상태를 나타내는 생물학적 지표와 혈소판 예민도가 정상화 되었다.
  • 카테킨 처리효과는 철이 축적된 동물에서만 나타났으며, 대조 동물에서는 효과가 없었다. 알려진 카테킨(혹은 이의 대사 산물)의 항산화 특성으로 보아, 철분 축적에 의한 혈소판의 과민은 산화 손상에 의해 혈소판 칼슘 항상성이 변화되었기 때문이라고 설명할 수 있다. 카테킨의 보호 효과는 아마도 항산화 상태의 정상화를 통해서 이루진 것으로 나타났다. Choi J. H. 등(78)은 뼈 대사 질환에 미치는 카테킨의 효능과 그리고 만성 카드뮴 중독된 쥐에서 그 메커니즘을 조사하였다.
  • 카드뮴 해독이 일어나면 뼈의 재흡수를 증가하였다. 카테킨을 투여한 집단에서는 소변 내에 있는 뼈 재흡수 지표가 감소하였다. 카드뮴-중독된 집단의 혈중 오스티오칼신 함량은 대조군에 비해 현저하게 증가하였다. 카테킨 투여 집단의 혈중 오스티오칼신 함량은 대조군에 비해 감소하였다. 카드늄 중독된 집단은 대조군에 비해 뼈 미네랄 밀도가 낮았다(전신, 척추, 골반, 경골, 퇴골). 카테킨을 투여하면 뼈의 미네랄 밀도가 대조군과 거의 같은 수준으로 증가하였다.
  • 뼈 미네랄 성분들은 전체의 뼈 미네랄 밀도와 같은 경향을 보였다. 녹차 카테킨은 만성 카드늄 중독에 의해 일어나는 질환에 있어서 뼈 미네랄 밀도, 뼈 미네랄 함량과 뼈 칼슘 함량을 정상시키는데 도움을 주었다.
  • 종전의 연구에 의하면, 녹차나 카테킨에 의한 금속 이온의 흡수 조절이 전립선암 예방의 중요한 방법이리라 암시되어왔다. 그러나, 현재까지 녹차가 금속이온의 흡수에 영향을 줌으로 전립선 암의 화학적 예방 효과를 한다는 직접적인 보고는 없다. 녹차나 카테킨이 금속 이온의 흡수에 어떠한 영향을 주는 지는 아마도 미래의 연구에 초점이 될 것이다.
  • 3.2 카테킨과 금속 이온의 반응 및 전립선암 세포의 성장에 주는 영향
  • 종전의 여러 보고에 의하면 녹차는 중금속의 독성을 감소시키고, 중금속 이온과 반응함으로 많은 암들을 예방할 수 있다고 한다.. 그러나, 실제 녹차가 금속 이온과 반응을 하여 전립선 암을 예방한다는 직접적인 증거는 없었다. 우리는 EGCG가 구리 이온 존재 하에 전립선 암 세포에 어떠한 영향을 주는지 조사하였다(40-42). PC-3과 LNCaP 세포배양을 이용하여, EGCG, Cu2+, 그리고 이들이 동시에 존재할 때 전립선 암 세포의 성장에 미치는 영향과 그 작용 메커니즘; 세포배양에서 EGCG의 함량의 변화, F-12 배지화학형광 농도의 동력적 변화와 EGCG,구리 이온 또는 이들의 공존시의 자유 라디칼의 생성을 조사하였다.
  • 여러 농도의 Cu2+이 있는 상태에 EGCG를 넣어주면, EGCG는 EGCG/ Cu2+의 농도비가 상당히 높지 않는 한 Cu2+에 의한 LNCaP 세포의 사망을 촉진시켰다. EGCG는 모든 집단에 서 Cu2+의 PC-3세포에 대한 독성을 억제하였다. Cu2+를 F-12 배지에 마지막으로 가하면, EGCG의 독성이 LNCaP 에서 급격하게 증가하였으나, PC-3세포에서는 그렇지 않았다.
  • EGCG에 의한 PC-3 세포의 죽음은 Cu2+의 농도가 충분히 높지 않은 이상 촉진되지 않았다.
  • EGCG를 전처리하면 Cu2+에 의한 독성이 LNCaP 세포에서 감소하였다. 낮은 농도의 EGCG는 Cu2+에 의한 PC-3 세포의 치사율이 감소하였으며, 높은 농도의 EGCG는 높은 농도의 Cu2+에 의해 독성을 억제하였으나 낮은 농도의 Cu2+는 PC-3 세포에 독성을 유발하였다.
  • EGCG가 맨 마지막 가해졌을 때, Cu2+에 의한 LNCaP 세포의 손상이 Cu2+에 대해서 EGCG/Cu2+ 농도비가 충분히 높지 않은 이상 억제 되지 않았으며, EGCG는 PC-3 세포에서는 농도와 관계없이 Cu2+에 의한 독성을 감소시킬 수 없었다. 또한, flow cytometry나 전기영동의 결과로 보면, 세포의 괴사가 PC-3 세포와 LNCaP 세포의 성장의 억제의 주 원인이었으며, 세포사멸은 거의 발견되지 않았다. 우리는 전립선암 세포배양에서 세포괴사와 세포막의 손상의 특성을 밝혔으며 세포막이 EGCG, Cu2+과 이들의 결합물의 중요한 표적이 될 수 있음을 보여주었다.
  • PC-3 세포가 있을 때와 없을 때, F12 배지에서 EGCG의 함량을 HPLC로 조사하였다. PC-3 세포가 없을 때, F-12 배지의 EGCG 함량은 37℃, 5% CO2에서 빠른 속도로 감소하였다. EGCG 함량의 변화 경향은 전립선암 세포의 존재 유무에 따라 달랐다.
  • EGCG는 PC-3세포가 있을 때는 6 시간 후에 세포농도와는 관계없이 사라졌는데, 아주 적은 양의 LNCap 세포가 있을 때도 같은 현상을 보였다. 우리는 PCA세포가 EGCG와 반응할 수도 있다고 가정하였다. Cu2+는 F-12 배지 내의 EGCG 함량의 변화에 영향을 줄 수도 있는데, 이런 변화는 투여한 농도와 Cu2+를 투여한 순서와 관계가 있다. EGCG 는 전립선암 세포가 들어있는 모든 군에서 6시간 뒤에 사라졌는데, 이러한 현상은 아마도 PC-3의 흡수와 EGCG가 관련이 있는 것 같다. EGCG는 세포의 내부와 외부에서 작용을 한다.
  • EGCG와 Cu2+의 반응이 전립선암 세포의 세포질 막 손상의 원인이 되며, EGCG와 그 유도체들 전립선암 세포 안으로 들어가 세포의 성장에 영향을 줄 수 있다. 그러나, EGCG의 유도체들, 특이 그 금속 이온과의 결합물들은 전립선암 세포의 성장에 영향을 주는 중요한 성분이었다.
  • 화학형광 시험에서, F-12 배지 내 형광의 밀도가 EGCG 또는 Cu2+를 가한 후에 증가하였는데, 이 형광밀도의 변화는 가한 농도와 시간에 비례하였다. EGCG와 가 함께 존재하면, F-12 배지 내 형광밀도가 변하는데, 가한 농도, 가한 순서, 그리고 시간에 의해 영향을 받았다.
  • 우리는 ESR 기술을 이용하여 Cu2+가 포함하는 F-12 배지에 EGCG의 존재와는 무관하게 ?OH가 존재한다는 사실을 알아냈다. ?OH의 양은 Cu2+와 EGCG의 농도와 가한 순서에 따라 변하였다. 따라서 EGCG와 Cu2+의 상호작용은 이들의 농도와 가한 순서에 영향을 받는다.

  • http://www.teascience.or.kr/8_3_3.htm


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